ΠΑΚΕΤΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕ3

ΠΕ3.1. In–vitro και in–vivo Δοκιμές υγρών μιγμάτων ως παράγοντες φυτοπροστασίας εναντίον των φυτοπαθογόνων του φυλλώματος και του εδάφους των φυτών και των δένδρων.

Οι in–vitro δοκιμές θα πραγματοποιηθούν με διαφορετικές μεθόδους, ώστε να υπάρχει αξιοπιστία και δυνατότητα άντλησης κατά το δυνατόν ασφαλών συμπερασμάτων:

• Με μελέτη των ζωνών αναστολής με τη μέθοδο των πηγαδιών (βοθρίων) ή των χάρτινων δίσκων, όπου μετά από επίστρωση του μικροοργανισμού στόχου σε κατάλληλο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (π.χ. Nutrient agar για βακτήρια, Potato Dextrose agar για ζύμες-μύκητες) θα τοποθετηθεί στο κέντρο του τριβλίου η υγρή αντιμικροβιακή ουσία (υγρό μίγμα εκχυλισμάτων πολυφαινόλης ελιάς και υπολειμμάτων χυμοποίησης ροδιού ή/και πορτοκαλιού) και θα μετρηθεί μετά από επώαση η ζώνη αναστολής (mm) γύρω από την αντιμικροβιακή ουσία.
• Με μελέτη της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC-Minimum Inhibitory Concentration) και της ελάχιστης θανατηφόρου συγκέντρωσης (ΜLC-Minimum Lethal Concentration) σε κατάλληλο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα ανάπτυξης (π.χ. Nutrient broth για βακτήρια, Potato Dextrose broth για ζύμες-μύκητες) με αύξουσα συγκέντρωση της υγρής αντιμικροβιακής ουσίας.

Συγκεκριμένα, θα μελετηθεί η δράση εναντίον φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών με ενδιαφέρον σε γεωργικές εφαρμογές και συγκεκριμένα εδαφογενείς και υπέργειου τμήματος φυτοπαθογόνοι μύκητες όπως Verticillium dahliae, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Eutypa lata, Monilia laxa, Pyrenochaeta lycopersici, Phoma punicae, Aspergillus niger και Gaumanomyces graminis.

Μετά το τέλος της in vitro αξιολόγησης των μιγμάτων εκχυλισμάτων πρόκειται να επιλεγούν τα περισσότερο αποτελεσματικά μίγματα για κάθε ένα φυτοπαθογόνο μύκητα, ώστε να περιοριστεί ο αριθμός των in vivo πειραμάτων.

Για την in vivo αξιολόγηση της δράσης των επιλεγμένων μιγμάτων εκχυλισμάτων πολυφαινόλης ελιάς και υπολειμμάτων χυμοποίησης ροδιού ή/και πορτοκαλιού εναντίον φυτοπαθογόνων μυκήτων (που θα εμβολιαστούν σε φυτά τομάτας) θα αξιολογηθεί η επίδραση των μυκήτων στην ανάπτυξη των φυτών τομάτας, καθώς επίσης και η δυνατότητα των επεμβάσεων μιγμάτων πολυφαινολών να περιορίζουν την ανάπτυξη και δράση των φυτοπαθογόνων μυκήτων με την αξιολόγηση του ύψους, του νωπού και ξηρού βάρους υπέργειου και υπόγειου τμήματος, καθώς και του αριθμού ανθέων και καρπών της τομάτας. Στόχος του πειράματος είναι ο προσδιορισμός του αποτελεσματικότερου μίγματος που ταυτόχρονα δε θα προκαλεί προβλήματα φυτοτοξικότητας στην καλλιέργεια.

Μία σημαντική επιδίωξη του συγκεκριμένης υποενότητας εργασίας είναι να προταθεί ένα ή περισσότερα από τα παραγόμενα υγρά μίγματα συνεργισμού σαν βέλτιστη σύνθεση για αντιμετώπιση φυτοπαθογόνων του εδάφους και ένα ή περισσότερα σαν βέλτιστη σύνθεση εναντίον των φυτοπαθογόνων του φυλλώματος των φυτών. 

2. ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΣΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΤΟΥ ΠΑΚΕΤΟΥ ΕΡΓΑΣΙΑΣ & ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Στο πρώτο στάδιο της έρευνας, αξιολογήθηκε η in vitro (πείραμα σε τριβλία) αντιμικροβιακή δραστικότητα των πολυφαινολών εναντίον σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων όπως οι μύκητες Verticillium dahliae και Fusarium oxysporum που προκαλούν την ασθένεια αδρομύκωση στην τομάτα και ο Botrytis cinerea, είδος το οποίο προσβάλει τα άνθη, τα φύλλα και κυρίως τους καρπούς των φυτών προκαλώντας μετασυλλεκτικές σήψεις. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η δράση τους εναντίον των φυτοπαθογόνων μυκήτων Rhizoctonia solani, Eutypa lata, Monilia laxa, Pyrenochaeta lycopersici, Phoma punicae, Aspergillus niger και Gaumanomyces graminis. Όλα τα είδη των μυκήτων που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από συλλογή του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου.

Για την αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης των παραγόμενων πολυφαινολών εναντίον σημαντικών φυτοπαθογόνων ειδών εφαρμόστηκαν οι ακόλουθες τεχνικές:

• Μέτρηση ζωνών αναστολής (Well diffusion assay)
• Ρυθμός εξάπλωσης του μυκηλίου σε τριβλία Petri

με σκοπό τον προσδιορισμό της ελάχιστης επίδρασης διαφόρων συγκεντρώσεων και συνδυασμών 72 εκχυλισμάτων πολυφαινολών ελιάς, ροδιού και πορτοκαλιού.

Τμήμα των μυκηλιακών υφών από το αρχικό μέσο (τριβλία με PDA) τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικούς σωλήνες οι οποίοι περιείχαν κεκλιμένο θρεπτικό υπόστρωμα PDA και οδηγήθηκαν στο ψυγείο στους 3 ^οC για να συντηρηθούν για περισσότερο χρονικό διάστημα. Η διεξαγωγή των πειραμάτων και η αξιολόγηση της δραστικότητας των προς εξέταση δειγμάτων πολυφαινολών που προέρχονται από επεξεργασία αποβλήτων ελαιοτριβείων, διενεργήθηκε με χρήση τμημάτων και σπορίων των μυκήτων από αυτό το υλικό.

Στο δεύτερο στάδιο της έρευνας, αξιολογήθηκε in vivo (συνθήκες θερμοκηπίου) η αποτελεσματικότητα των 11 πιο δραστικών εκχυλισμάτων πολυφαινολών (όπως προέκυψαν από το πείραμα εργαστηρίου) εναντίον 4 σημαντικών φυτοπαθογόνων ειδών (Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Pyrenochaeta lycopersici και Botrytis cinerea) κατόπιν επιμόλυνσης τους σε φυτά τομάτας ηλικίας 15 ημερών (στάδιο τρίτου πραγματικού φύλου), ποικιλίας Bella Dona.

Στο πείραμα θερμοκηπίου, αξιολογήθηκαν το ύψος των φυτών τομάτας, το νωπό και ξηρό βάρος του υπέργειου και του υπόγειου τμήματος των φυτών, καθώς και ο αριθμός ανθέων και καρπών.

Τα αποτελέσματα του πειράματος εργαστηρίου (in vitro) έδειξαν ότι το εκχύλισμα πολυφαινόλης ελιάς, καθώς και τα μίγματα αυτού με μικρό ποσοστό εκχυλισμάτων πορτοκαλιού ή ροδιού περιόρισαν σε υψηλό ποσοστό (έως και 100%) την ανάπτυξη των φυτοπαθογόνων μυκήτων Botrytis cinerea, Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Eutypa lata, Monilia laxa, Pyrenochaeta lycopersici και Phoma punicae. Εντούτοις, τα εκχυλίσματα που αξιολογήθηκαν δεν περιόρισαν σημαντικά την ανάπτυξη των φυτοπαθογόνων μυκήτων Fusarium oxysporum, Aspergillus niger και Gaumanomyces graminis.

Τα αποτελέσματα του πειράματος θερμοκηπίου (in vivo) έδειξαν ότι τα εκχυλίσματα ήταν μετρίως έως πολύ αποτελεσματικά εναντίον των τεσσάρων φυτοπαθογόνων μυκήτων. Ειδικότερα, το μίγμα που περιείχε τα εκχυλίσματα ελιάς:ροδιού:πορτοκαλιού σε αναλογία 80:12:8 προκάλεσε ταυτόχρονα μείωση της ανάπτυξης και των τεσσάρων μυκήτων, με αποτέλεσμα η ανάπτυξη των φυτών τομάτας να είναι ίδια με εκείνη των φυτών του μη μολυσμένου μάρτυρα.

Τα παραπάνω αποτελέσματα είναι πολύ ενθαρρυντικά και δείχνουν τη δυνατότητα των εκχυλισμάτων πολυφαινολών ελιάς, ροδιού και πορτοκαλιού να αναπτυχθούν μελλοντικά σε αποτελεσματικά φυσικά γεωργικά φάρμακα.